1、選擇合適的超濾管。通常應(yīng)截留分子量不應(yīng)大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量為35kDa，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管。若目的蛋白分子量為10kD左右，則可以用截留分子量3kD的超濾管。認(rèn)真閱讀使用說(shuō)明書(shū)，注意超濾膜對(duì)各種化學(xué)物質(zhì)的耐受程度有所不同。
 

　　2、新買來(lái)的超濾是干燥的，使用前加入超純水，水量*過(guò)膜，冰浴或冰箱里預(yù)冷幾分鐘。然后將水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超過(guò)管頂?shù)陌拙€為準(zhǔn)。操作要輕，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預(yù)冷。
 

　　3、平衡。質(zhì)量和重心二者都要達(dá)到平衡。注意轉(zhuǎn)速和加速度不可太快，否則直接損壞超濾膜。開(kāi)始離心超濾(離心機(jī)預(yù)冷至4度)。不同離心機(jī)的轉(zhuǎn)速 rpm換算成g之后，有所不同。離心機(jī)的加速度調(diào)至*低檔，減小對(duì)膜的壓力。注意，一定要等離心機(jī)達(dá)到目的轉(zhuǎn)速之后，方可離開(kāi)離心機(jī)，否則離心機(jī)出問(wèn)題時(shí)，無(wú)法*時(shí)間處理。膜與轉(zhuǎn)軸的方向根據(jù)說(shuō)明書(shū)調(diào)整(角轉(zhuǎn)離心機(jī)的情況是膜與軸垂直)。在實(shí)際使用中，一般轉(zhuǎn)速開(kāi)的比說(shuō)明書(shū)里的要低，這樣可以延長(zhǎng)離心管的使用壽命。
 

　　4、當(dāng)濃縮到剩下1ml時(shí)，取50ul緩沖溶液，加入10ul流穿，看有沒(méi)變藍(lán)色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了，將上層和流穿重新倒入新管中開(kāi)始超濾。要判斷是否漏管，用5mgml的BSA離心10min，再取流穿，跑蛋白膠或Bradford粗測(cè)，繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮(在冰上操作，防止蛋白受熱)，直到所有濃縮液都加完為止。離心過(guò)程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀，導(dǎo)致堵管。若發(fā)生沉淀，要確定沉淀的具體原因，是蛋白濃度過(guò)高還是Buffer不合適；前者可用多根超濾管同時(shí)超濾，降低濃度的辦法解決，后者的方法是換不同的緩沖溶液，直到蛋白不發(fā)生沉淀為止。
 

　　5、前面幾步用以濃縮蛋白，如果要換Buffer，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時(shí)候，輕輕加入新的Buffer(經(jīng)0.22um超濾膜超濾)，再 濃縮至1ml左右，連續(xù)三次，*后一次的濃縮終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定，一般不多于500ul，也有濃縮至200ul以內(nèi)的情況。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算，三次達(dá)到1000倍以上，基本上可以達(dá)到換buffer的目的。